SetFilePointer(hFile,1,NULL,FILE_BEGIN); //（1）先頭3バイト読む
ReadFile(hFile,buf,3,&readsize,NULL); // bufはchar
buf[3] = ('\0');

SetFilePointer(hFile,0,NULL,FILE_CURRENT); //（2）先頭から4バイト目を読む（1）の続きを読みたい
ReadFile(hFile,buf,1,&readsize,NULL);
buf[1] = ('\0');

if (buf==0x01)
{
MessageBox(hWnd,"aaa","bbb",MB_OK); //（3）4バイト目は01だからメッセージが出るんじゃ？
}

度々質問ですが、
こんな感じで、まず（1）で先頭から3バイトバイナリを読みます。
次に（2）で（1）の続き（先頭から4バイト目）を読みます。
例えば、バイナリで「41 42 43 01」なら（1）はABCになると思います。
でも、（3）のメッセージが出ません。
if　の所の比較が変なんでしょうか？